|
Süperoksit dismutaz (SOD) oksijenli solunum yapan tüm organizmalarda bulunan antioksidan nitelikte bir enzimdir. Enzim, gerek dış kaynaklı gerek hücresel metabolizma kaynaklı olarak ortaya çıkan süperoksit anyonunun etkisizleştirilmesi reaksiyonunu gerçekleştirir. Bu işlevini aktif merkezinde yer alan çinko ve bakır iyonlarını kofaktör olarak kullanarak yapar. Amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) genellikle orta yaştaki insanlarda ortaya çıkan hareket yeteneği kaybı ve kas erimesiyle seyreden, genellikle solunum durmasına bağlı olarak ölümle sonuçlanan nörodejeneratif tipte bir hastalıktır. Hastalığın sporadik (SALS) ve kalıtsal olmak (FASL) üzere iki tipi mevcuttur. Kalıtsal olarak ortaya çıktığı durumların %20'sinde SOD enzimini kodlayan gende 120'den fazla nokta mutasyonu tanımlanmıştır. Bu mutasyonlar enzimin üç boyutlu yapısını etkilemekte, bunun sonucunda kofaktörlerini bağlayıcı özellikleri değişmekte, antioksidan niteliğini kaybedip kendisi oksitleyici bir ajan haline dönüşmektedir. Enzimin kofaktörlerinden biri olan bakırın enzime sağlanmasında rol oynayan taşıyıcı protein tanımlanmışsa da çinkonun enzime nasıl taşındığı bilinmemektedir. Öte yandan, ALS patogenezinde, ilgili kofaktörlerin enzime bağlanma özelliklerinin hastalığın gelişimini etkileyebileceği bildirilmektedir. Bu nedenle kofaktörlerin enzime bağlanma dinamiklerinin ortaya konması büyük önem kazanmaktadır. Bu çalışmada tek hücreli bir maya türü olan Schizosaccharomyces pombe kullanılarak SOD'a çinkonun nasıl taşındığı araştırılacaktr. Enzimin yapısal özelliklerinden hareket edilerek aday proteinler biyoinformatik çalışmayla belirlenecek ve bu proteinlerin enzimle ilişkilenip ilişkilenmediği çinko taşıyıp taşımadığı deneysel olarak tespit edilmeye çalışılacaktır. Çalışmadan elde edilecek bulguların ALS'nin gelişim mekanizmalarının moleküler düzeyde anlaşılmasında çok önemli veriler sağlayacağı düşünülmektedir.
Araştırmalar: 1.SOD geniyle kısmi benzerlik gösteren dizilerin taranması
Projeden elde edilecek verilerin, özelikle nörodejeneratif tip bir hastalık olan amiyotrofik lateral skleroz'un gelişiminde metal dengesizliğinin etkisine ilişkin katkı sağlayacağı ve şimdiye dek dikkate alınmayan çinko taşıyıcı proteinlerin hastalığın gelişimine etkilerine dair yeni hipotezler üretebileceği düşünülmektedir.
Superoksit dismutaz enziminin kofaktörü olan çinkonun enzime nasıl taşındığı bu güne dek araştırılmamış bir konudur. Amiyotrofik lateral skleroz hastalığının gelişiminde enzimin üç boyutlu yapısının kararlılığının bozulmasının etkili olabileceği öne sürülüyorsa da kararlılığı sağlayan çinkonun taşınım mekanizması bu anlamda değerlendirilmemiştir. Çalışma bu boşluğu doldurmak anlamında bir adım olacaktır.
|
|
Bu projenin amacı hasarlı proteinleri, proteomik tekniklerle belirleyerek ilgili süreçlere ışık tutmaktır. Çalışmanın ilk aşamasında oksidatif stres uygulanacak hücre soylarındaki hasarlı proteinler HPLC, iki boyutlu elektroforez, Western blotting ve Maldi-tofve Q-tof teknikleriyle tanımlanacak ve hücrelerin antioksidan savunma sistemleri irdelenecek; ikinci aşamada çeşitli bitki ekstrelerinin, peynir altı suyu fraksiyonlarının ve referans antioksidanların aktivitesi değerlendirilecektir.
Araştırmalar: Çalışmanın ilk aşamasında oksidatif stres uygulanacak kanserli hücre soylarındaki (C6 sıçan glioma ve HeLa hücre hatları) hasarlı proteinler HPLC, iki boyutlu elektroforez, Western blotting ve Maldi-tof teknikleriyle tanımlanacak ve hücrelerin antioksidan savunma sistemleri çeşitli biyokimsayal analizlerle irdelenecek; ikinci aşamada ise laboratuarımızda hazırlanmış çeşitli bitki ekstreleri, peynir altı suyu fraksiyonları ve referans antioksidanların hücreler üzerindeki aktivitesi değerlendirilecektir. Analitik verilerin karşılaştırılmasında tek yönlü ANOVA testi, Dunnet ve student t testi gibi istatistiksel yöntemler kullanılacaktır. Jel ve/veya membran üzerindeki protein bant ve spotları gelişmiş görüntüleme sistemlerinde analiz edilecek, kütle spektrometrisinde elde edilen verilerle birlikte uygun software programları kullanılarak uluslararası veri bankalarında taranacak ve in silico değerlendirmeler yapılacaktır.
|
